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《自然》:歐洲根據已知基因序列合成新冠病毒,助力疫苗開發

文章來源:澎湃新聞
2020-05-06 22:57



  當地時間5月4日,國際頂級學術期刊《自然》(Nature)以“加快評審文章”(Accelerated Article Preview)形式在線發表了來自瑞士、德國、俄羅斯多家科研機構的一項研究“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”。團隊在已知新冠病毒基因序列的基礎上,首次在試驗中通過反向遺傳學手段在酵母菌中快速構建出了活的新冠病毒。論文中提到,反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具,它徹底改變了我們對病毒發病機制和疫苗開發的認識。

  論文通訊作者為瑞士伯爾尼大學病毒學與免疫學研究所的Volker Thiel以及該校獸醫學院傳染病與病理生物學學系的Joerg Jores。該研究工作早在當地時間2月21日在線發表于預印本網站BioRxiv,當時未經同行評議。

  值得注意的是,這是一項根據已知病毒基因組進行病毒重建的基礎研究工作,該成果與此前的謠言之一“新冠病毒是人工合成的” 無關,本研究中實驗室中構建的新冠病毒是在疫情暴發后,根據已經公布的病毒基因組序列進行的病毒重建研究。

  研究團隊指出,化學合成新冠病毒,尤其在新暴發病毒尚未被成功分離出之前,可以幫助科學家盡快向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株,還可以對單個基因進行遺傳修飾和功能表征,從而爭取時間對疫情暴發做出快速反應。

  大型的RNA病毒基因組,如冠狀病毒基因組,由于基因組較大且不穩定,很難在大腸桿菌宿主中克隆和操作。研究團隊此次報道了一個基于酵母的合成基因組學平臺,用于多種RNA病毒的基因重建,包括冠狀病毒科、黃病毒科和副粘病毒科的成員。

  研究團隊首先在其他RNA病毒(如鼠肝炎病毒MHV)中檢驗了基于酵母的合成基因組學平臺的準確度,團隊測試了鼠肝炎病毒A59株中含有綠色熒光蛋白(MHV GFP)的基因克隆能力,結果表明測試的克隆中正確組裝了MHV基因組的YAC占90%,這表明病毒在酵母中的組裝效率很高。

  也正是利用該平臺,研究人員在拿到合成DNA片段后一周內,對新冠病毒進行了工程改造和復活。

  具體來看,研究團隊將病毒基因組分成12個片段,大小在0.5kbp-3.4kbp。同時,為了便于血清學診斷和在細胞培養時追蹤,研究團隊將合成新冠病毒設計成可以表達GFP(綠色熒光蛋白)。因此,研究團隊又將片段11分成3個包含GFP序列的子片段,GFP序列被插入ORF7a(開放閱讀框,ORF)中,從而總計有14個片段。

  研究團隊讓試劑公司化學合成上述14個DNA片段,1月14日下訂單,2月4日拿到其中的12個片段。片段5和7在大腸桿菌中的克隆出現一些問題未能完成。不過,研究團隊恰好同時獲得了慕尼黑一位患者的新冠病毒樣本(SARS-CoV-2/München1.1/2020/929),他們決定利用RT-PCR擴增獲得片段5和片段7。

  利用TAR克隆,對于所有6種新冠病毒構建體,研究人員都獲得了正確組裝的分子克隆。隨后,利用轉化偶聯重組技術 (TAR),用酵母菌的同源重組系統依據末端重復的序列,將這些DNA序列拼到一起。獲得完整的病毒序列后,用T7 RNA聚合酶將這一DNA序列轉錄為病毒RNA,將該RNA用電穿孔技術導入到VeroE6(猴腎細胞)中,使得細胞被感染,培養這些細胞的上清液(含釋放出的病毒顆粒)注入到別的培養基中,可以感染別的細胞。

  研究團隊進而表示,“我們能在獲取病毒的合成DNA片段后僅一周的時間內,對最近流行的新冠病毒的化學合成克隆進行工程改造和復活?!辈《镜闹亟M有很高的效率和準確度,通常情況下,超過90%的克隆是正確的。

  值得注意的是,除新冠病毒外,研究團隊還報道了利用該技術合成構建MHV(鼠肝炎病毒,一種冠狀病毒)和MERS-Cov等,HCov-229E和Zika病毒的構建仍在實驗進行中。





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